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Funktionelle Analyse des Proteinkinase A Ankerproteins Ht31
Blum, Christopher Thorsten Friedrich

HaupttitelFunktionelle Analyse des Proteinkinase A Ankerproteins Ht31
TitelvarianteFunctional Analysis of the Protein Kinase A Anchoring Protein Ht31
AutorBlum, Christopher Thorsten Friedrich
Geburtsort: Christopher Blum, Neunkirchen/Saar, Deutschland
GutachterProf. Dr. Walter Rosenthal
weitere GutachterProf. Dr. Hartmut Oschkinat
Freie SchlagwörterAKAP-Ht31, Estrogen Receptor, PKA, Rho, Signal Transduction
DDC540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
ZusammenfassungAKAP-Ht31/AKAP-Lbc gehört zu der Familie der A kinase anchoring proteins. Es weist eine ubiquitäre Verbreitung auf und ist in seiner Interaktion mit verschiedenen anderen physiologisch relevanten Proteinen in zahlreiche regulatorische Zellprozesse eingebunden.

In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst anti-AKAP-Ht31-Antikörper in Kreuz-Immunpräzipitationsstudien mit MCF-7-Zellen getestet, um ihre Spezifität gegen AKAP-Ht31-Spleißvarianten zu charakterisieren. Insgesamt konnten im Western Blot nach Immunpräzipitation bis zu neun mögliche AKAP-Ht31-Spleißvarianten mit Molekulargewichten von 70 kDa bis >250 kDa detektiert werden.

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden AKAP-Proteine der Größen 40 kDa, 60 kDa, 80 kDa und 160 kDa in MCF-7-Zellen mittels einer cAMP-Agarose-Präzipitation angereichert und anhand des RII-overlays detektiert. Der nukleare Steroid/Thyroid-Rezeptor ERα wurde ebenfalls nach cAMP-Agarose-Präzipitation im Western Blot detektiert. Dies spricht für das Vorhandensein eines Komplexes aus einem funktionellen AKAP-Protein, daran gebundenen ERα und, über die RII-Bindungsdomäne des AKAP-Protein verankerter, PKA.

Die Identifizierung potentiell beteiligter AKAP-Ht31-Spleißvarianten nach Immunpräzipitation im RII-overlay führte zu vier Proteinen. Zwei Proteine mit einem Molekulargewicht >220 kDa, von denen das größere wahrscheinlich das gesamte AKAP-Ht31/AKAP-Lbc (309 kDa) und das kleinere eine weitere AKAP-Ht31-Spleißvariante oder ein proteolytisches Abbauprodukt darstellt. Des Weiteren kommt die AKAP-Ht31-Spleißvariante Brx und eine 80-kDa-Protein als Interaktionspartner von ERα in Frage. In Immunfluoreszenzstudien in MCF-7-Zellen konnte gezeigt werden, dass zumindest eine AKAP-Ht31-Variante in unbehandelten Zellen mit ERα kolokalisiert und nach E2-Behandlung mit dem Rezeptor in den Nukleus transloziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vollständige AKAP-Ht31/AKAP-Lbc und/oder eine kleinere Variante mögliche Interaktionspartner von ERα sind.

Um AKAP-Ht31 vollständig zu erhalten (ein 4,5-kb-Fragment des 3’-Endes existierte bereits), wurde das 5’-Ende seiner Nukleotidsequenz aus einer humanen Nieren-cDNA-Expressionsbibliothek (Stratagene, Heidelberg) kloniert.

Aus dem vollständigen wildtypischen Klon von AKAP-Ht31/AKAP-Lbc wurden die klassische Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-RII), die nicht-kanonische (zweite) Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-2.RII) und die Pleckstrin-homology und Dbl-homology (DHPH-) Domäne als GFP-Konstrukte kloniert.

Dokumente
FUDISS_derivate_000000001708
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Fachbereich/EinrichtungFB Biologie, Chemie, Pharmazie
Erscheinungsjahr2005
Dokumententyp/-SammlungenDissertation
Medientyp/FormatText
SpracheDeutsch
RechteNutzungsbedingungen
Tag der Disputation24.05.2005
Erstellt am22.12.2005 - 00:00:00
Letzte Änderung19.02.2010 - 11:51:56
 
Alte Darwin URLhttp://www.diss.fu-berlin.de/2005/346/
Statische URLhttp://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000001708
URNurn:nbn:de:kobv:188-2005003466
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