In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst anti-AKAP-Ht31-Antikörper in Kreuz-Immunpräzipitationsstudien mit MCF-7-Zellen getestet, um ihre Spezifität gegen AKAP-Ht31-Spleißvarianten zu charakterisieren. Insgesamt konnten im Western Blot nach Immunpräzipitation bis zu neun mögliche AKAP-Ht31-Spleißvarianten mit Molekulargewichten von 70 kDa bis >250 kDa detektiert werden.

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden AKAP-Proteine der Größen 40 kDa, 60 kDa, 80 kDa und 160 kDa in MCF-7-Zellen mittels einer cAMP-Agarose-Präzipitation angereichert und anhand des RII-overlays detektiert. Der nukleare Steroid/Thyroid-Rezeptor ERα wurde ebenfalls nach cAMP-Agarose-Präzipitation im Western Blot detektiert. Dies spricht für das Vorhandensein eines Komplexes aus einem funktionellen AKAP-Protein, daran gebundenen ERα und, über die RII-Bindungsdomäne des AKAP-Protein verankerter, PKA.

Die Identifizierung potentiell beteiligter AKAP-Ht31-Spleißvarianten nach Immunpräzipitation im RII-overlay führte zu vier Proteinen. Zwei Proteine mit einem Molekulargewicht >220 kDa, von denen das größere wahrscheinlich das gesamte AKAP-Ht31/AKAP-Lbc (309 kDa) und das kleinere eine weitere AKAP-Ht31-Spleißvariante oder ein proteolytisches Abbauprodukt darstellt. Des Weiteren kommt die AKAP-Ht31-Spleißvariante Brx und eine 80-kDa-Protein als Interaktionspartner von ERα in Frage. In Immunfluoreszenzstudien in MCF-7-Zellen konnte gezeigt werden, dass zumindest eine AKAP-Ht31-Variante in unbehandelten Zellen mit ERα kolokalisiert und nach E₂-Behandlung mit dem Rezeptor in den Nukleus transloziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vollständige AKAP-Ht31/AKAP-Lbc und/oder eine kleinere Variante mögliche Interaktionspartner von ERα sind.

Um AKAP-Ht31 vollständig zu erhalten (ein 4,5-kb-Fragment des 3’-Endes existierte bereits), wurde das 5’-Ende seiner Nukleotidsequenz aus einer humanen Nieren-cDNA-Expressionsbibliothek (Stratagene, Heidelberg) kloniert.

Aus dem vollständigen wildtypischen Klon von AKAP-Ht31/AKAP-Lbc wurden die klassische Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-RII), die nicht-kanonische (zweite) Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-2.RII) und die Pleckstrin-homology und Dbl-homology (DHPH-) Domäne als GFP-Konstrukte kloniert.